Enzýmové inžinierstvo spojené s rastom prostredníctvom manipulácie s regeneráciou redoxného kofaktora

Čoraz širšia škála chemikálií sa v súčasnosti vyrába z obnoviteľných surovín biotechnologickými prostriedkami. Bioprocesy sa vo veľkej miere spoliehajú na enzymatickú katalýzu pre efektívnu výrobu týchto zlúčenín. Zabezpečenie optimálneho výkonu enzýmov v požadovanom prostredí je preto veľmi dôležité pre udržateľnú výrobu.

Vlastnosti, ako je špecifickosť substrátu, katalytická rýchlosť a (termo)stabilita, patria medzi niekoľko kritických faktorov, ktoré sa musia optimalizovať pre efektívne bioprocesy poháňané enzýmami. Táto optimalizácia môže byť časovo náročná, nákladná a náročná, a preto sú veľmi vyhľadávané efektívne a nákladovo efektívne spôsoby pravdepodobne pre výber spojený s rastom, inžinierske enzýmy s požadovanými vlastnosťami.

Výhody použitia selekcie spojenej s rastom ako formy výberu enzýmov, ktorá zahŕňa spojenie aktivity enzýmu s rastom bunky. Táto metóda sa môže použiť ako stratégia výberu s vysokou priepustnosťou a dá sa dosiahnuť buď zabezpečením toho, aby rast závisel od syntézy produktu cieľovým enzýmom, alebo prepojením aktivity enzýmu s globálnym energetickým stavom bunky. Syntetická biológia sa môže použiť na vytvorenie kmeňov vhodných na výber spojený s rastom a nedávny pokrok sa zameral na inžinierske kmene nedostatočné v oxidovaných alebo redukovaných stavoch redoxných kofaktorových párov, ktoré môžu slúžiť ako platformy enzýmového inžinierstva. Používanie týchto platforiem môže urýchliť vývoj zlepšených biokatalyzátorov a bioprocesov.

Výhody rastovej väzby prostredníctvom kofaktorovej auxotrofie

Výhody použitia kofaktorovej auxotrofie ako selekčnej metódy pre inžinierstvo enzýmov zapojených do biosyntézy určitých chemikálií, ako sú lipidy, biopalivá, plyny, organické rozpúšťadlá alebo polymérne zlúčeniny. Tento prístup ponúka niekoľko jedinečných výhod, vrátane možnosti vybrať si požadovaný produkt nezávisle od substrátu alebo produktu, ktorý je predmetom záujmu, čo uľahčuje detekciu zlepšenej enzymatickej aktivity a ponúka odčítanie na detekciu zlepšenej enzymatickej aktivity. Okrem toho je použitie kofaktorových auxotrofov ako platforiem na spájanie rastu prospešné, pretože všadeprítomná povaha redoxných kofaktorov v mikrobiálnom metabolizme znamená, že inžinierske stratégie môžu byť laterálne prenosné na iné zaujímavé mikróby a enzýmy môžu byť priamo navrhnuté v prostredí požadovaného mikrobiálneho hostiteľa. (znázornené ako obrázok 1)

Obrázok 1: Porovnanie niekoľkých široko používaných skríningových/selekčných techník pre enzýmové inžinierstvo

Mutanty s nedostatkom oxidácie NADH

K oxidácii NADH v E. coli môže dôjsť dvoma cestami v závislosti od dostupnosti kyslíka. V aeróbnych podmienkach sa NADH oxiduje hlavne dýchaním, aby sa vytvoril ATP, zatiaľ čo v anaeróbnych podmienkach sa môže oxidovať fermentačnými cestami za vzniku laktátu a etanolu. Mutantné kmene E. coli, ktoré nie sú schopné použiť zmiešané fermentačné dráhy na oxidáciu NADH počas anaeróbneho rastu, boli použité na riadenie oxidačných dráh NADH pre anaeróbnu syntézu rôznych chemikálií, ako je 2-metylpropán-1-ol, 2,3-butándiol, 1-butanol a L-alanín. Tieto mutantné kmene boli tiež použité na vytvorenie enzýmov využitím podobných redoxných princípov, čo viedlo k zlepšeniu variantov. Výsledné kmene sa môžu použiť na vytvorenie iných enzýmov a dráh závislých od NAD(P)H.

Mutanti s nedostatkom v redukcii NAD+

Wenk et al. vytvorili kmeň E. coli odstránením génu dihydrolipoyldehydrogenázy (lpd), čo viedlo k tomu, že kmeň nebol schopný generovať redukčný výkon (NADH a NADPH) z metabolizmu acetátov v dôsledku absencie aktivity pyruvátdehydrogenázy. To spôsobilo, že kmeň vykazoval auxotrofiu na zníženie výkonu pri aeróbnom pestovaní na acetáte ako jedinom zdroji uhlíka. (znázornené ako obrázok 2) Kmeň bol schopný rásť na acetáte, keď bol doplnený hornými glykolytickými substrátmi alebo pri expresii nad+-závislých formate-, etanolových alebo metanoldehydrogenáz s ich príslušnými substrátmi. Kmeň sa nepoužíval na enzýmové inžinierstvo a hodnotil sa iba na redoxnú kofaktorovú auxotrofiu.
 

Obrázok 2: Centrálny metabolizmus

Mutanty s nedostatkom oxidácie NADPH

Existujú dve rôzne stratégie na indukciu NADP+ auxotrofie v E. coli, spoliehajúc sa na inžinierstvo glykolytickej dráhy na nadprodukciu NADPH. Prvá stratégia zahŕňa odstránenie natívneho génu gapA a expresiu heterológneho enzýmu GAPDH závislého od NADP+, zatiaľ čo druhá stratégia zahŕňa presmerovanie toku uhlíka cez pentózovú fosfátovú dráhu. Výsledné kmene nie sú schopné rásť na glukóze, ale vykazujú rast v rôznych podmienkach, pričom prvý kmeň sa pestuje v anaeróbnych podmienkach a druhý v aeróbnych podmienkach s glycerolom ako substrátom. Tieto kmene sa používajú na inžinierstvo enzýmov so zlepšenými vlastnosťami, vrátane špecifickosti substrátu, katalytickej aktivity a termostability.

Mutanty s nedostatkom v redukcii NADP+

Tri rôzne baktérie, E. coli, P. putida a C. glutamicum, boli skonštruované tak, aby boli NADPH-auxotrofické, čo znamená, že na rast vyžadujú exogénny NADPH. V prípade E. coli a C. glutamicum boli centrálne metabolické enzýmy vyradené, aby sa zabránilo redukcii NADP+, keď bola glukóza poskytnutá ako zdroj uhlíka, zatiaľ čo v prípade P. putida sa inžinierstvo s podporou CRISPR/nCas9 používalo na postupné narušenie súborov cieľových génov, aby sa pochopilo ich zapojenie do redoxného metabolizmu. NADPH-auxotrofické kmene sa potom použili na enzýmové inžinierstvo spojené s rastom na základe kofaktorovej špecifickosti. Jedno kolo mutagenézy s použitím E. coli prinieslo doteraz najúčinnejšiu a najšpecifickejšiu formate dehydrogenázu závislú od NADP+, zatiaľ čo P. putida a C. glutamicum predstavujú prvé kmene svojho druhu, ktoré možno použiť pre tento typ inžinierstva.

Mutanty s nedostatkom v redukcii NMN+

Bol vyvinutý selekčný systém spojený s rastom, ktorý spája kolobeh kofaktorov a rast na základe nedostatku v redukcii NMN+. Použil sa kmeň E. coli SHuffle, ktorý nesie delécie v dvoch génoch, ktoré sa podieľajú na produkcii redukovaného glutatiónu. Glutatión reduktáza závislá od NMNH bola vyvinutá prostredníctvom racionálnej mutagenézy na prepojenie procesu s cyklom NMN+/NMNH a glukózodehydrogenáza závislá od NMN+ bola použitá na podporu NMN+/NMNH kofaktorového cyklu, a teda rastu. Štúdia tiež po prvýkrát použila nekanonickú redoxnú kofaktorovú auxotrofiu pre enzýmové inžinierstvo spojené s rastom, čo viedlo k variantu termostabilnej fosfitdehydrogenázy so zlepšenou katalytickou účinnosťou a časovou stabilitou in vitro. Práca poskytuje užitočný kmeň pre enzýmové inžinierstvo spojené s rastom, závislé od cyklu NMN+/NMNH a auxotrofné pre znížený stav nekanonického redoxného kofaktora.

 

Potenciál prepojenia rastu prostredníctvom redoxných kofaktorov fungoval ako silný nástroj na vytváranie biokatalyzátorov, najmä v kontexte udržateľnej bioprodukcie. Hoci sa dosiahol značný pokrok v generovaní redoxných kofaktorových auxotrofických kmeňov, vyhlásenie naznačuje, že stále existuje niekoľko nepreskúmaných ciest pre výskum. Jedným z nich sú inžinierske kofaktorové auxotrofné kmene organizmov iných ako E. coli, ktoré by mohli otvoriť nové možnosti pre enzýmové inžinierstvo spojené s rastom.

Celkovo naznačuje, že použitie rastového spojenia založeného na redoxnom kofaktore predstavuje veľkú príležitosť pre inžiniersku biokatalýzu, najmä na výrobu produktov, ktoré nedokážu uspokojiť požiadavky iných prístupov enzýmového inžinierstva s vysokou priepustnosťou. Zdôrazňuje potrebu vyvinúť všestrannejšie a účinnejšie biokatalyzátory pre udržateľnú bioprodukciu a zdôrazňuje význam pokračujúceho výskumu v tejto oblasti.


Referencie: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Enzýmové inžinierstvo spojené s rastom prostredníctvom manipulácie s regeneráciou redoxného kofaktora, Biotechnology Advances, 2023.