optimalizácia reakčných podmienok na dosiahnutie vysokého výťažku stévie rebaudiozidu d
Diéty s vysokým obsahom cukru viedli k rastúcej prevalencii rôznych chronických ochorení vrátane obezity, cukrovky, kardiovaskulárnych ochorení a hypertenzie, čo predstavuje významný globálny problém verejného zdravia. Stevia Rebaudioside D (Reb D), prírodné sladidlo pochádzajúce z rastlín, získalo značnú pozornosť ako náhrada cukru vďaka svojmu nulovému obsahu kalórií, intenzívnej sladkosti a príjemnému chuťovému profilu.
Jeho obmedzená prítomnosť v stevia rebaudiana Bertoni a problémy súvisiace s nízkou rozpustnosťou a enzymatickou aktivitou glykozyltransferázy rastlinného pôvodu však bránia jej širokému komerčnému využitiu. V reakcii na tieto problémy bola objavená nová glykozyltransferáza nazývaná YojK, pochádzajúca z Bacillus subtilis 168. Táto štúdia predstavuje geneticky modifikovanú bakteriálnu glykozyltransferázu, YojK-I241T/G327N, charakterizovanú vysokou rozpustnosťou a katalytickou účinnosťou, ktorá ponúka veľký potenciál pre priemyselnú výrobu Reb D.
Vývoj vysoko účinnej metódy na výrobu rebaudiozidu D pomocou kaskádovej reakcie enzýmov YojK-I241T/G327N a AtSuSy.
Na riešenie problému nízkej rozpustnosti v rastlinných glykozyltransferázach vedci skúmali potenciál použitia YojK, O-glykozyltransferázy z Bacillus subtilis 168. YojK bol vybraný kvôli jeho preukázanej glykozylačnej aktivite s rôznymi substrátmi, vrátane veľkých molekúl. Po úspešnej rekombinantnej expresii a purifikácii bol YojK použitý na glykozylát Reb A, čo viedlo k produkcii Stevia Reb D. Enzýmová kinetická analýza odhalila, že YojK má nižšiu katalytickú aktivitu voči Reb D v porovnaní s inými glykozyltransferázami. V dôsledku toho štúdia naznačuje potrebu inžinierstva riadeného štruktúrou, aby sa zvýšila katalytická aktivita spoločnosti YojK pre potenciálne praktické aplikácie. (ako je znázornené na obrázku 1)
Obrázok 1
Optimalizácia reakčných podmienok na dosiahnutie vysokého výťažku rebaudiozidu D.
Reakčné podmienky vrátane pH, teploty a koncentrácie substrátu je možné optimalizovať tak, aby sa dosiahol vysoký výťažok Srevie Reb D. Štúdia použila simulácie molekulárnej dynamiky na preskúmanie toho, ako variant YojK-I241T / G327N zvyšuje glykozyláciu Reb D. Variant si počas simulácií zachoval stabilnú vodíkovú väzbu medzi Reb A a H14, na rozdiel od divokého typu (ako je znázornené na obrázku 2). Táto stabilita sa rozšírila aj na vzdialenosť medzi atómom O2 Reb A a C1P UDPG. Zlepšená katalytická účinnosť variantu YojK-I241T/G327N bola pripísaná týmto stabilným interakciám, čo naznačuje jeho praktický potenciál.
Obrázok 2
Obrázok 3
Záver
Tento prístup priniesol 83,47% Reb D. Najmä pridanie 1 mM UDPG umožnilo syntézu 20,59 g/l Reb D s pozoruhodným výťažkom 91,29%, čím prekonalo predchádzajúce štúdie. Tento proces demonštruje potenciál priemyselnej výroby Reb D, najmä po stavebnom inžinierstve spoločnosti YojK.YojK môže byť účinne exprimovaný v E. coli BL21 (DE3) s vysokou rozpustnosťou. Prostredníctvom štruktúrou riadeného inžinierstva bol vytvorený dvojitý mutant, YojK-I241T/G327N, ktorý umožňuje veľkovýrobu Reb D s výnimočným výnosom 91,29% recykláciou UDPG katalyzovaného sacharózou syntázou AtSuSy. Táto štúdia predstavuje YojK-I241T/G327N ako sľubný nástroj pre ekonomicky efektívnu priemyselnú výrobu Reb D.
