Kvantifikácia NAD+ a jeho metabolitov v sedacích nervoch myší
Zavedenie
Rozhodujúce zložky nikotínamid adenín dinukleotidu (NAD +) a jeho metabolitov pri starnutí a neurodegenerácii boli široko uznávané. Na podnietenie pokroku smerom k biochemickému výskumu a intervenciám zameraným na starnutie a neurodegeneratívne ochorenia je veľmi dôležité presne kvantifikovať hladiny NAD + a jeho metabolitov v záchrannej dráhe NAD +. Tu sa používa robustná a presná metóda LC-MS/MS na kvantifikáciu hladín NAD + a jeho metabolitov v normálnom a poranenom sedacom nerve myší.
Obmedzenia existujúcich metód kvantifikácie NAD+ a jeho metabolitov
Tradičné metódy kvantifikácie NAD+ a jeho metabolitov, ako sú HPLC-UV, NMR, elektroforéza v kapilárnej zóne alebo kolorimetrické enzymatické testy, čelia rôznym výzvam v oblasti citlivosti, selektivity a nepriameho merania. Pokiaľ ide o existujúce testy LC-MS/MS pre bunkové alebo tkanivové merania NAD + a jeho metabolitov, stále je potrebné prekonať veľa ťažkostí, ako sú predĺžené doby chodu, zlé chromatografické retenčné správanie a neuspokojivé tvary píkov. Okrem toho sa týmito metódami môže pokryť len jedna až tri látky v ceste záchrany NAD +.
Modifikácie metódy LC-MS/MS
Na základe existujúcich testov LC-MS/MS sa vykonávajú modifikácie týkajúce sa chromatografických podmienok, náhradnej matrice a podmienok MS/MS. Konkrétne sa 5 μM kyseliny metylénfosfónovej používa ako prísada mobilnej fázy, ktorá explicitne podporuje intenzitu signálu a tvar píku. Vzhľadom na relatívne čistú a jednoduchú povahu nikdy vzoriek a ich malú veľkosť sa ultračistá voda testuje ako náhradná matrica. Namiesto hydrofilnej interakčnej kvapalinovej chromatografickej kolóny a hyperkarbónovej kolóny sa používa kolóna Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, ktorej jedinečná vysokovýkonná povrchová technológia MaxPeak HPS (pasivácia vnútornej steny kolóny, eliminácia kovového povrchu) umožňuje vysokú reprodukovateľnosť, symetriu píkov a základnú separáciu všetkých analytov.Okrem toho sú podmienky MS optimalizované tak, aby minimalizovali rušivý signál NAD + v kanáli cyklickej adenozíndifosfát ribózy (cADPR) pri zachovaní odozvy cADPR a nikotínamid mononukleotidu (NMN), so 4000 V pre napätie iónového rozprašovania, 450 °C pre teplotu turbo ohrievača, 50 psi pre plyn 1, 50 psi pre plyn 2, 30 psi pre záclonový plyn a 12 psi pre kolízny plyn.
Reprezentatívny chromatogram nervových vzoriek (normálne vs. poranené)
Všetkých päť analytov dosahuje východiskovú separáciu, kde cADPR je citlivý biomarker v neurodegeneračnom modeli. Axotómia sedacieho nervu indukuje axonálnu degeneráciu, čo vedie k zníženiu hladiny NAD + a zvýšenej hladine NMN v poranených nervoch, čo vedie k približne 2-násobnému zvýšeniu pomeru NMN / NAD +. Súčasne sa hladiny nikotínamidu (NAM) a adenozíndifosfátribózy (ADPR) znižujú asi 2-násobne, zatiaľ čo hladina cADPR sa zvyšuje viac ako 8-násobne. Tieto výsledky sú v súlade s výsledkami predtým uvádzaného výskumu, ktorý overuje presnosť tejto modifikovanej metódy LS-MS/MS pri kvantifikácii NAD + a jeho metabolitov.
Záver
Táto modifikovaná metóda LC-MS/MS umožňuje efektívne základné oddelenie NAD+, NMN, NAM, ADPR a cADPR v krátkom čase behu 5 minút, čo prispieva k včasnej diagnostike rôznych neurologických porúch a vývoju liekov na starnutie a neurodegeneratívne ochorenia.
Referencia
Ma Y, Deng L, Du Z. Vývoj a validácia metódy LC-MS/MS na kvantifikáciu NAD + a príbuzných metabolitov v sedacích nervoch myší a jej aplikácia na zvierací model s poškodením nervov. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821
BONTAC NAD
BONTACsa od roku 2012 venuje výskumu a vývoju, výrobe a predaju surovín pre koenzýmy a prírodné produkty, s vlastnými továrňami, viac ako 170 globálnymi patentmi, ako aj silným tímom výskumu a vývoja. Spoločnosť BONTAC má bohaté skúsenosti s výskumom a vývojom a pokročilú technológiu v oblasti biosyntézyNAD a jeho predchodcovia(napr. NMN a NR). Na výber sú rôzne typy NAD, ktoré zahŕňajú stupeň NAD ER (odstránenie endoxínu), stupeň NAD I (IVD/doplnok stravy/kozmetický surový prášok), stupeň II NAD (API/medziprodukty) a stupeň IV NAD (ak existuje vyššia požiadavka na rozpustnosť), ktoré môžu byť poskytnuté vo forme lyofilizovaného prášku alebo kryštalického prášku. Čistota BONTAC NAD môže dosiahnuť aj viac ako 98 %.
Vyhlásenie
Tento článok vychádza z odkazu v akademickom časopise. Príslušné informácie sa poskytujú len na účely zdieľania a vzdelávania a nepredstavujú žiadne lekárske účely. Ak dôjde k porušeniu autorského práva, požiadajte autora o odstránenie. Názory vyjadrené v tomto článku nevyjadrujú stanovisko skupiny BONTAC. Spoločnosť BONTAC za žiadnych okolností nenesie žiadnu zodpovednosť za akékoľvek nároky, škody, straty, výdavky alebo náklady vyplývajúce alebo vyplývajúce priamo alebo nepriamo z vášho spoliehania sa na informácie a materiály na tejto webovej stránke.