Kvantifikácia NAD+ a jeho metabolitov v sedacích nervoch myší
Úvod
Kľúčové úlohy nikotínamidadeníndinukleotidu (NAD+) a jeho metabolitov pri starnutí a neurodegenerácii sú všeobecne uznávané. Na podporu pokroku v biochemickom výskume a intervenciách zameraných na starnutie a neurodegeneratívne ochorenia je veľmi dôležité presne kvantifikovať NAD+ a hladiny jeho metabolitov v záchrannom cykle NAD+. Tu sa na kvantifikáciu hladín NAD+ a jeho metabolitov v normálnom a poškodenom sedacom nerve myši aplikuje robustná a presná metóda LC-MS/MS.Obmedzenia existujúcich metód na kvantifikáciu NAD+ a jeho metabolitov
Tradičné metódy na kvantifikáciu NAD+ a jeho metabolitov, ako sú HPLC-UV, NMR, kapilárna zónová elektroforéza alebo kolorimetrické enzymatické testy, čelia rôznym výzvam v oblasti citlivosti, selektivity a nepriameho merania. Pokiaľ ide o existujúce testy LC-MS/MS na meranie NAD+ a jeho metabolitov v bunkách alebo tkanivách, stále existuje mnoho ťažkostí, ktoré treba prekonať, ako sú predĺžené časy analýzy, slabé chromatografické retenčné správanie a neuspokojivé tvary píkov. Navyše týmito metódami možno pokryť iba jednu až tri látky v záchrannom cykle NAD+.Modifikácie metódy LC-MS/MS
Na základe existujúcich testov LC-MS/MS sa vykonávajú modifikácie týkajúce sa chromatografických podmienok, náhradnej matrice a podmienok MS/MS. Konkrétne sa ako aditívum do mobilnej fázy používa 5 μM kyseliny metylénfosfónovej, ktorá výrazne zvyšuje intenzitu signálu a tvar píkov. Vzhľadom na relatívne čistú a jednoduchú povahu vzoriek a ich malú veľkosť sa ako náhradná matrica testuje ultračistá voda. Namiesto kolóny na hydrofilnú interakčnú chromatografiu a kolóny hypercarb sa používa kolóna Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, ktorej jedinečná technológia MaxPeak HPS s vysokovýkonným povrchom (pasivácia vnútornej steny kolóny, eliminácia kovového povrchu) umožňuje vysokú reprodukovateľnosť, symetriu píkov a základnú separáciu všetkých analytov.Okrem toho sú optimalizované podmienky MS, aby sa minimalizoval interferenčný signál NAD+ v kanáli cyklického adenozíndifosfátribózy (cADPR) pri zachovaní odozvy cADPR a nikotínamidmononukleotidu (NMN), s napätím iónového spreja 4000 V, teplotou turbo ohrievača 450 ℃, tlakom plynu 1 50 psi, tlakom plynu 2 50 psi, tlakom clonového plynu 30 psi a tlakom kolízneho plynu 12 psi.
Reprezentatívny chromatogram vzoriek nervov (normálne vs. poškodené)
Všetkých päť analytov dosahuje základnú separáciu, pričom cADPR je citlivý biomarker v modeli neurodegenerácie. Tu axotómia sedacieho nervu indukuje axonálnu degeneráciu, čo vedie k zníženej hladine NAD+ a zvýšenej hladine NMN v poškodených nervoch, čo vedie k približne 2-násobnému zvýšeniu pomeru NMN/NAD+. Súčasne sa hladiny nikotínamidu (NAM) a adenozíndifosfátribózy (ADPR) znížia približne 2-násobne, zatiaľ čo hladina cADPR sa zvýši viac ako 8-násobne. Tieto výsledky sú v súlade s výsledkami predtým publikovaného výskumu, čo potvrdzuje presnosť tejto modifikovanej metódy LC-MS/MS pri kvantifikácii NAD+ a jeho metabolitov.
Záver
Táto modifikovaná metóda LC-MS/MS umožňuje účinnú základnú separáciu NAD+, NMN, NAM, ADPR a cADPR v krátkom čase analýzy 5 minút, čo prispieva k včasnej diagnostike rôznych neurologických porúch a vývoju liekov na starnutie a neurodegeneratívne ochorenia.Referencie
Ma Y, Deng L, Du Z. Vývoj a validácia metódy LC-MS/MS na kvantifikáciu NAD+ a príbuzných metabolitov v sedacích nervoch myší a jej aplikácia na zvierací model poškodenia nervov. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACsa od roku 2012 venuje výskumu, vývoju, výrobe a predaju surovín pre koenzýmy a prírodné produkty, s vlastnými továrňami, viac ako 170 globálnymi patentmi a silným výskumným tímom. BONTAC má bohaté výskumné skúsenosti a pokročilé technológie v biosyntézeNAD a jeho prekurzory(napr. NMN a NR). K dispozícii sú rôzne typy NAD, vrátane NAD ER Grade (odstránenie endotoxínov), NAD Grade I (IVD/doplnok stravy/kozmetický surový prášok), NAD Grade II (API/medziprodukty) a NAD Grade IV (ak sú vyššie požiadavky na rozpustnosť), ktoré môžu byť poskytnuté vo forme lyofilizovaného prášku alebo kryštalického prášku. Čistota BONTAC NAD môže dosiahnuť viac ako 98%.
