Kvantifikácia NAD+ a jeho metabolitov v myších ischiatických nervoch
Úvod
Kľúčové zložky nikotínamid adenín dinukleotidu (NAD+) a jeho metabolity pri starnutí a neurodegenerácii boli široko uznávané. Aby sa podporil pokrok v biochemickom výskume a intervenciách zameraných na starnutie a neurodegeneratívne ochorenia, je mimoriadne dôležité presne kvantifikovať NAD+ a jeho hladiny metabolitov v záchrannej dráhe NAD+. Tu sa aplikuje robustná a presná metóda LC-MS/MS na kvantifikáciu NAD+ a jeho hladiny metabolitov v normálnom a poškodenom sedacom nerve myši.Obmedzenia existujúcich metód kvantifikácie NAD+ a jeho metabolitov
Tradičné metódy kvantifikácie NAD+ a jeho metabolitov, ako sú HPLC-UV, NMR, kapilárna zónová elektroforéza alebo kolorimetrické enzymatické testy, čelia rôznym výzvam v citlivosti, selektivite a nepriamom meraní. Čo sa týka existujúcich LC-MS/MS testov pre bunkové alebo tkanivové merania NAD+ a jeho metabolitov, stále existuje mnoho ťažkostí, ktoré treba prekonať, ako sú predĺžené doby behu, zlé chromatografické retenčné správanie a neuspokojivé tvary vrcholov. Navyše, tieto metódy môžu byť pokryté len jednou až tromi látkami v NAD+ záchrannej dráhe.Modifikácie metódy LC-MS/MS
On the basis of existing LC-MS/MS assays, the modifications regarding the chromatographic conditions, surrogate matrix and MS/MS conditions are conducted. Specifically, 5 μM of methylene phosphonic acid is employed as the mobile phase additive, which explicitly promotes the signal intensity and peak shape. Given the relatively clean and simple nature of never samples and their small size, ultrapure water is tested as a substitute matrix. Instead of hydrophilic interaction liquid chromatography column and hypercarb column, the Waters Atlantis Premier BEH C18 AX column is utilized, whose unique MaxPeak HPS high-performance surface technology (passivating the column inner wall, eliminating metal surface) enables the high reproducibility, peak symmetry, and baseline separation of all analytes. Okrem toho sú podmienky MS optimalizované tak, aby minimalizovali rušivý signál NAD+ v cyklickom kanáli adenozín difosfátu ribózy (cADPR) pri zachovaní odozvy cADPR a mononukleotidu nikotínamidu (NMN), pričom iónové napätie je 4000 V, teplota turboohrievača 450 °C, plyn 1 50 psi, plyn 2 50 psi, záclonový plyn 30 psi a plyn pri kolízii 12 psi.
Reprezentatívny chromatogram nervových vzoriek (normálne vs zranené)
Všetkých päť analytov dosahuje separáciu základnej hodnoty, pričom cADPR je citlivým biomarkerom v neurodegeneračnom modeli. V tomto prípade axotómia sedacieho nervu vyvoláva axonálnu degeneráciu, čo vedie k zníženej hladine NAD+ a zvýšenej hladine NMN v poškodených nervoch, čo vedie približne k dvojnásobnému zvýšeniu pomeru NMN/NAD+. Súčasne sa hladiny nikotínamidu (NAM) a adenozín difosfát ribózy (ADPR) znížia približne dvojnásobne, zatiaľ čo hladina cADPR sa zvýši viac ako 8-násobne. Tieto výsledky sú v súlade s predchádzajúcimi štúdiami, ktoré overujú presnosť tejto modifikovanej metódy LS-MS/MS pri kvantifikácii NAD+ a jeho metabolitov.
Záver
Táto upravená metóda LC-MS/MS umožňuje efektívne základné oddelenie NAD+, NMN, NAM, ADPR a cADPR v krátkom priebehu 5 minút, čo prispieva k včasnej diagnostike rôznych neurologických porúch a vývoju liekov na starnutie a neurodegeneratívne ochorenia.Referencie
Ma Y, Deng L, Du Z. Vývoj a validácia metódy LC-MS/MS na kvantifikáciu NAD+ a príbuzných metabolitov u ischiatických nervov myší a jej aplikácia na zvierací model s nervovým poranením. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC od roku 2012 sa venuje výskumu a vývoju, výrobe a predaju surovín pre koenzýmy a prírodné produkty, s vlastnými továrňami, viac ako 170 globálnymi patentmi a silným tímom výskumu a vývoja. BONTAC má bohaté skúsenosti s výskumom a vývojom a pokročilé technológie v biosyntéze NAD a jeho predchodcovia (napr. NMN a NR). Existuje niekoľko typov NAD, ktoré sa vyberajú, vrátane NAD ER Grade (odstránenie endoxínu), NAD Grade I (IVD/výživový doplnok/kozmetický surový prášok), NAD Grade II (API/medziprodukty) a NAD Grade IV (ak je vyššia rozpustnosť), ktoré môžu byť poskytnuté vo forme lyofilizovaného prášku alebo kryštalického prášku. Čistota BONTAC NAD môže presiahnuť 98 %.
