Kvantifikácia NAD+ a jeho metabolitov v sedacích nervoch myší
Zavedenie
Rozhodujúce časti nikotínamid-adeníndinukleotidu (NAD+) a jeho metabolitov pri starnutí a neurodegenerácii boli široko uznávané. Na urýchlenie pokroku smerom k biochemickému výskumu a intervenciám zameraným na starnutie a neurodegeneratívne ochorenia je veľmi dôležité presne kvantifikovať NAD+ a jeho hladiny metabolitov v záchrannej dráhe NAD+. Tu sa používa robustná a presná metóda LC-MS/MS na kvantifikáciu hladín NAD+ a jeho metabolitov v normálnom a poranenom sedacom nerve myší.Obmedzenia existujúcich metód kvantifikácie NAD+ a jeho metabolitov
Tradičné metódy kvantifikácie NAD+ a jeho metabolitov, ako sú HPLC-UV, NMR, elektroforéza kapilárnej zóny alebo kolorimetrické enzymatické testy, čelia rôznym výzvam v citlivosti, selektivite a nepriamom meraní. Pokiaľ ide o existujúce LC-MS/MS testy pre bunkový alebo tkanivový NAD+ a jeho metabolity, stále existuje veľa ťažkostí, ktoré treba prekonať, ako sú predĺžené doby chodu, zlé chromatografické retenčné správanie a neuspokojivé tvary píkov. Okrem toho tieto metódy môžu pokrývať iba jednu až tri látky v ceste záchrany NAD+.Modifikácie metódy LC-MS/MS
Na základe existujúcich skúšok LC-MS/MS sa vykonávajú modifikácie týkajúce sa chromatografických podmienok, náhradnej matrice a podmienok MS/MS. Konkrétne sa ako prísada mobilnej fázy používa 5 μM kyseliny metylénfosfónovej, ktorá explicitne podporuje intenzitu signálu a tvar píku. Vzhľadom na relatívne čistú a jednoduchú povahu nikdy nevyvinutých vzoriek a ich malú veľkosť sa ultračistá voda testuje ako náhradná matrica. Namiesto kolóny kvapalinovej chromatografie s hydrofilnou interakciou a hyperkarbovej kolóny sa používa kolóna Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, ktorej jedinečná vysokovýkonná povrchová technológia MaxPeak HPS (pasivácia vnútornej steny kolóny, eliminácia kovového povrchu) umožňuje vysokú reprodukovateľnosť, symetriu píkov a základnú separáciu všetkých analytov.Okrem toho sú podmienky MS optimalizované tak, aby minimalizovali interferenčný signál NAD+ v kanáli cyklickej adenozíndifosfátribózy (cADPR) pri zachovaní odozvy cADPR a nikotínamidmononukleotidu (NMN), s napätím 4000 V pre iónové rozprašovacie napätie, 450 ° C pre teplotu turbo ohrievača, 50 psi pre plyn 1, 50 psi pre plyn 2, 30 psi pre záclonový plyn a 12 psi pre kolízny plyn.
Reprezentatívny chromatogram vzoriek nervov (normálny vs zranený)
Všetkých päť analytov dosiahne základnú separáciu, kde cADPR je citlivým biomarkerom v neurodegeneračnom modeli. Tu axotómia sedacieho nervu indukuje degeneráciu axónov, čo vedie k zníženiu hladiny NAD+ a zvýšenej hladine NMN v poškodených nervoch, čo vedie k približne 2-násobnému zvýšeniu pomeru NMN / NAD+. Súčasne sa hladiny nikotínamidu (NAM) a adenozíndifosfátribózy (ADPR) znižujú približne 2-násobne, zatiaľ čo hladina cADPR sa zvyšuje viac ako 8-násobne. Tieto výsledky sú v súlade s výsledkami predtým oznámeného výskumu, ktorý overuje presnosť tejto modifikovanej metódy LS-MS/MS pri kvantifikácii NAD+ a jeho metabolitov.
Záver
Táto modifikovaná metóda LC-MS/MS umožňuje efektívnu základnú separáciu NAD+, NMN, NAM, ADPR a cADPR v krátkom priebehu 5 minút, čo prispieva k včasnej diagnostike rôznych neurologických porúch a vývoju liekov na starnutie a neurodegeneratívne ochorenia.Referencia
Ma Y, Deng L, Du Z. Vývoj a validácia metódy LC-MS/MS na kvantifikáciu NAD+ a príbuzných metabolitov sedacích nervov myší a jej aplikácia na zvierací model poranenia nervov. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACsa od roku 2012 venuje výskumu a vývoju, výrobe a predaju surovín pre koenzýmy a prírodné produkty s vlastnými továrňami, viac ako 170 globálnymi patentmi, ako aj silným výskumným a vývojovým tímom. BONTAC má bohaté skúsenosti s výskumom a vývojom a pokročilú technológiu v oblasti biosyntézyNAD a jeho prekurzory(napr. NMN a NR). Existujú rôzne typy NAD, ktoré sa majú vybrať, vrátane stupňa NAD ER (odstránenie endotoxínov), NAD triedy I (IVD / výživový doplnok / kozmetický surový prášok), NAD stupeň II (API / medziprodukty) a NAD stupeň IV (ak existuje vyššia požiadavka na rozpustnosť), ktoré môžu byť poskytnuté vo forme lyofilizovaného prášku alebo kryštalického prášku. Čistota BONTAC NAD môže dosiahnuť viac ako 98%.
