Optimalizácia reakčných podmienok na dosiahnutie vysokého výťažku Stevia rebaudiosid D
Diéty s vysokým obsahom cukru viedli k rastúcemu výskytu rôznych chronických ochorení, vrátane obezity, cukrovky, kardiovaskulárnych ochorení a hypertenzie, čo predstavuje významný globálny problém pre verejné zdravie. Stevia Rebaudioside D (Reb D), prírodné sladidlo získané z rastlín, si získalo veľkú pozornosť ako náhrada cukru vďaka svojmu nulovému obsahu kalórií, intenzívnej sladkosti a príjemnému chuťovému profilu.
Jej obmedzená prítomnosť v stevia rebaudiana Bertoni a problémy spojené s nízkou rozpustnosťou a enzymatickou aktivitou rastlinnej glykosyltransferázy však bránili jej širokému komerčnému využitiu. V reakcii na tieto problémy bola objavená nová glykosyltransferáza nazývaná YojK, pochádzajúca z Bacillus subtilis 168. Táto štúdia predstavuje geneticky modifikovanú bakteriálnu glykosyltransferázu, YojK-I241T/G327N, charakterizovanú vysokou rozpustnosťou a katalytickou účinnosťou, čo ponúka veľký potenciál pre priemyselnú výrobu Reb D.
Vývoj vysoko efektívnej metódy výroby rebaudiosidu D pomocou kaskádovej reakcie enzýmov YojK-I241T/G327N a AtSuSy.
To address the issue of low solubility in plant-derived glycosyltransferases, researchers investigated the potential of using YojK, an O-glycosyltransferase from Bacillus subtilis 168. YojK was chosen because of its demonstrated glycosylation activity with various substrates, including large molecules. After successful recombinant expression and purification, YojK was employed to glycosylate Reb A, resulting in the production of Stevia Reb D. Enzyme kinetic analysis revealed that YojK has lower catalytic activity toward Reb D compared to other glycosyltransferases. Consequently, the study suggests the necessity for structure-guided engineering to enhance YojK's catalytic activity for potential practical applications. (as shown in Obrázok 1)
Obrázok 1
Optimalizácia reakčných podmienok na dosiahnutie vysokého výťažku rebaudiosidu D.
The reaction conditions, including pH, temperature, and substrate concentration, can be optimized to achieve a high yield of Srevia Reb D. The study used molecular dynamics simulations to investigate how the YojK-I241T/G327N variant enhances Reb D glycosylation. The variant maintained a stable hydrogen bond between Reb A and H14 during simulations, unlike the wild-type(as shown in Obrázok 2). This stability also extended to the distance between Reb A's O2 atom and UDPG's C1P. The YojK-I241T/G327N variant's improved catalytic efficiency was attributed to these stable interactions, suggesting its practical potential.
Obrázok 2
Obrázok 3
Záver
Tento prístup priniesol 83,47 % Reb D. Pozoruhodné je, že pridanie 1 mM UDPG umožnilo syntézu 20,59 g/L Reb D s pozoruhodným výnosom 91,29 %, čím prekonali predchádzajúce štúdie. Tento proces demonštruje potenciál priemyselnej výroby Reb D, najmä po konštrukčnom inžinierstve YojK.YojK môže byť efektívne exprimovaný v E. coli BL21 (DE3) s vysokou rozpustnosťou. Vďaka štruktúrne riadenému inžinierstvu bol vytvorený dvojitý mutant YojK-I241T/G327N, ktorý umožnil veľkovýrobu Reb D s výnimočným výťažkom 91,29 % recykláciou UDPG katalyzovanej sacharózovou syntázou AtSuSy. Táto štúdia predstavuje YojK-I241T/G327N ako sľubný nástroj pre ekonomicky efektívnu priemyselnú výrobu Reb D.
