Inžinierstvo rastovo viazaných enzýmov prostredníctvom manipulácie s regeneráciou redoxných kofaktorov

Čoraz širšia škála chemikálií sa teraz vyrába z obnoviteľných surovín prostredníctvom biotechnologických prostriedkov. Bioprocesy sa vo veľkej miere spoliehajú na enzymatickú katalýzu pre efektívnu produkciu týchto zlúčenín. Zabezpečiť, aby enzýmy fungovali optimálne v požadovanom prostredí, je preto veľmi dôležité pre udržateľnú produkciu.

Vlastnosti ako špecificita substrátu, katalytická rýchlosť a (termo)stabilita patria medzi niekoľko kľúčových faktorov, ktoré musia byť optimalizované pre efektívne bioprocesy poháňané enzýmami. Táto optimalizácia môže byť časovo náročná, nákladná a náročná, a preto sú efektívne a nákladovo efektívne spôsoby, pravdepodobne pre rastovo viazaný výber, pričom inžinierske enzýmy s žiaducimi vlastnosťami sú veľmi žiadané.

Výhody využitia selekcie viazanej na rast ako formy výberu enzýmov, ktorá zahŕňa prepojenie aktivity enzýmu s rastom bunky. Táto metóda sa môže použiť ako stratégia výberu s vysokou priepustnosťou a dá sa dosiahnuť buď zabezpečením, že rast závisí od syntézy produktov cieľovým enzýmom, alebo prepojením aktivity enzýmu s globálnym energetickým stavom bunky. Syntetická biológia môže byť použitá na inžinierstvo kmeňov vhodných pre rastovo viazaný výber a nedávne pokroky sa zameriavajú na inžinierstvo kmeňov nedostatočných v oxidovaných alebo redukovaných stavoch párov redoxných kofaktorov, ktoré môžu slúžiť ako platformy pre inžinierstvo enzýmov. Použitie týchto platforiem môže urýchliť vývoj vylepšených biokatalyzátorov a bioprocesov.

Výhody rastovej väzby prostredníctvom kofaktorovej auxotrofie

Výhody použitia auxotrofie kofaktora ako selekčnej metódy na inžinierstvo enzýmov zapojených do biosyntézy určitých chemikálií, ako sú lipidy, biopalivá, plyny, organické rozpúšťadlá alebo polymérne zlúčeniny. Tento prístup ponúka niekoľko jedinečných výhod, vrátane možnosti vybrať požadovaný produkt nezávisle od substrátu alebo produktu, čo uľahčuje detekciu zlepšenej enzymatickej aktivity a ponúka zobrazenie na detekciu zlepšenej enzymatické aktivity. Okrem toho je použitie auxotrofov kofaktorov ako rastových spojovacích platforiem prospešné, pretože všadeprítomná povaha redoxných kofaktorov v mikrobiálnom metabolizme znamená, že inžinierske stratégie môžu byť laterálne prenositeľné na iné mikróby záujmu a enzýmy môžu byť priamo navrhnuté v prostredí požadovaného mikrobiálneho hostiteľa. (znázornené na obrázku 1)

Obrázok 1: Porovnanie niekoľkých široko používaných techník skríningu/selekcie pre enzýmové inžinierstvo

Mutanty nedostatočné v oxidácii NADH

Oxidácia NADH v E. coli môže prebiehať dvoma cestami, v závislosti od dostupnosti kyslíka. Za aeróbnych podmienok sa NADH hlavne oxiduje dýchaním na tvorbu ATP, zatiaľ čo v anaeróbnych podmienkach môže byť oxidovaný fermentačnými dráhami na produkciu laktátu a etanolu. Mutantné kmene E. coli, ktoré nedokážu využívať zmiešané fermentačné dráhy na oxidáciu NADH počas anaeróbneho rastu, boli použité na pohon oxidačných dráh NADH pre anaeróbnu syntézu rôznych chemikálií, ako sú 2-metylpropan-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol a L-alalanín. Tieto mutantné kmene boli tiež použité na inžinierstvo enzýmov využitím podobných redoxných princípov, čo viedlo k vylepšeným variantom. Výsledné kmene môžu byť použité na inžinierstvo iných enzýmov a dráh závislých od NAD(P)H.

Mutanti s nedostatkom redukcie NAD+  

Wenk a kol. vytvorili kmeň E. coli vymazaním génu dihydrolipoyldehydrogenázy (LPD), čo spôsobilo, že kmeň nedokázal generovať redukčnú silu (NADH a NADPH) z metabolizmu acetátu kvôli absencii aktivity pyruvátdehydrogenázy. To spôsobilo, že kmeň vykazovala auxotrofiu na zníženie výkonu pri aeróbnom pestovaní na acetáte ako jedinom zdroji uhlíka. (znázornené na obrázku 2) Kmeň mohol rásť na acetáte, ak bol doplnený hornými glykolytickými substrátmi alebo keď exprimoval NAD+-dependentné formate-, etanol- alebo metanol-dehydrogenázy s ich príslušnými substrátmi. Kmeň nebol použitý na inžinierstvo enzýmov a bol hodnotený iba na redoxný kofaktor auxotrofiu.
 

Obrázok 2: Centrálny metabolizmus 

Mutanty nedostatočné v oxidácii NADPH

Existujú dve rôzne stratégie na vyvolanie auxotrofie NADP+ u E. coli, ktoré sa spoliehajú na inžinierstvo glykolytickej dráhy na nadmernú produkciu NADPH. Prvá stratégia spočíva v vymazaní natívneho génu gapA a expresii heterologického enzýmu GAPDH závislého od NADP+, zatiaľ čo druhá stratégia spočíva v presmerovaní toku uhlíka cez dráhu pentózového fosfátu. Výsledné kmene nemôžu rásť na glukóze, ale vykazujú rast za rôznych podmienok, pričom prvý kmeň rastie v anaeróbnych podmienkach a druhý v aeróbnych podmienkach s glycerolom ako substrátom. Tieto kmene sa používajú na inžinierstvo enzýmov so zlepšenými vlastnosťami, vrátane špecificity substrátu, katalytickej aktivity a termostability.

Mutanti s nedostatkom redukcie NADP+

Tri rôzne baktérie, E. coli, P. putida a C. glutamicum, boli geneticky upravené tak, aby boli NADPH-auxotrofické, čo znamená, že na rast potrebujú exogénny NADPH. V prípade E. coli a C. glutamicum boli centrálne metabolické enzýmy vyradené, aby sa zabránilo zníženiu NADP+, keď bola glukóza poskytovaná ako zdroj uhlíka, zatiaľ čo u P. putida sa na postupné narušenie cieľových génov pomocou CRISPR/nCas9 použilo na pochopenie ich zapojenia do redoxného metabolizmu. NADPH-auxotrofické kmene boli následne použité na inžinierstvo rastovo viazaných enzýmov na základe kofaktorovej špecificity. Jedno kolo mutagenézy s použitím E. coli prinieslo najefektívnejšiu a najšpecifickejšiu NADP+-závislú formátovú dehydrogenázu doteraz, zatiaľ čo P. putida a C. glutamicum predstavujú prvé kmene svojho druhu, ktoré možno použiť na tento typ inžinierstva.

Mutanti s nedostatkom redukcie NMN+

Bol vyvinutý systém výberu viazaný na rast, ktorý spája cyklovanie kofaktorov a rast na základe nedostatku v znížení NMN+. Použil sa kmeň E. coli SHuffle, ktorý nesie delecie v dvoch génoch zapojených do produkcie redukovaného glutathionu. NMNH-závislá glutathión-reduktáza bola vyvinutá racionálnou mutagenézou na prepojenie procesu s cyklovaním NMN+/NMNH, a NMN+-závislá glukózdehydrogenáza bola použitá na podporu cyklovania NMN+/NMNH kofaktorov a tým aj rastu. Štúdia tiež po prvýkrát aplikovala nekanonickú redoxnú kofaktorovú auxotrofiu pre inžinierstvo rastovo viazaných enzýmov, čo viedlo k termostabilnému variantu fosfit dehydrogenázy so zlepšenou katalytickou účinnosťou a časovou stabilitou in vitro. Práca poskytuje užitočný kmeň pre inžinierstvo rastovo viazaných enzýmov, závislý na cyklovaní NMN+/NMNH a auxotrofický pre redukovaný stav nekanonického redoxného kofaktora.

Potenciál rastového prepojenia prostredníctvom redoxných kofaktorov fungoval ako silný nástroj na inžinierstvo biokatalyzátorov, najmä v kontexte udržateľnej bioprodukcie. Hoci sa dosiahol značný pokrok vo vytváraní auxotrofických kmeňov redox kofaktora, vyhlásenie naznačuje, že stále existuje niekoľko nepreskúmaných výskumných ciest. Jedným z nich je inžinierstvo auxotrofických kmeňov kofaktorov organizmov iných ako E. coli, čo by mohlo otvoriť nové možnosti pre inžinierstvo rastovo viazaných enzýmov.

Celkovo naznačuje, že použitie rastového prepojenia založeného na redox kofaktoroch predstavuje významnú príležitosť pre inžinierstvo biokatalýzy, najmä pri výrobe produktov, ktoré nedokážu splniť požiadavky iných vysokopriepustných prístupov k inžinierstvu enzýmov. Zdôrazňuje potrebu vyvíjať všestrannejšie a efektívnejšie biokatalyzátory pre udržateľnú bioprodukciu a zdôrazňuje dôležitosť pokračujúceho výskumu v tejto oblasti.


Referencia: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Growth-coupled enzyme engineering through manipulation of redox cofactor regeneration, Biotechnology Advances, 2023.